一、簡介
 

　　elisa酶聯(lián)免疫試劑盒是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用很廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應(yīng)板)表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。
 

　　二、成分
 

　　試劑盒內(nèi)包括以下試劑：
 

　　1.酶標(biāo)板(96孔板)
 

　　2.血清檢測抗體試劑(固定在小板上)
 

　　3.特異性標(biāo)記兔抗人IgG辣根過氧化物酶(HRP)
 

　　4.HRP底物染色液
 

　　5.固定酶標(biāo)板的NaCI-Pi緩沖液
 

　　6.去污液
 

　　7.色譜純洗板緩沖液
 

　　三、樣本類型
 

　　本試劑盒可檢測不同種類的生物樣本，包括：血清、血漿、組織抽提物、陽性參考樣本、陰性對照樣本等。不過首先要保證樣本與試劑之間無相互干擾。
 

　　四、儲藏
 

　　應(yīng)于2-8℃的陰涼干燥處存放。如需長期貯存，應(yīng)冷凍保存(-20℃或-80℃)。
 

　　五、試劑準(zhǔn)備
 

　　1.酶標(biāo)板制備：首先，在每個(gè)空白小孔板的每個(gè)孔中，添加50μL的PBS(0.01M)。然后將板放入一個(gè)旋轉(zhuǎn)式混合器中，溫和混合，管孔覆蓋在對應(yīng)的坑孔區(qū)域上，將坑孔以180度反轉(zhuǎn)，然后在抽走液體后，再次將坑孔埋入緩沖液中，丟棄PBS。最后，將板于坑孔中添加100µl的固定抗體，每個(gè)備件(坑孔)盡可能多添加固定抗體。
 

　　2.樣品制備：將樣品與樣品稀釋液按照比例混合。
 

　　3.銷量質(zhì)控制備：將陽性參考樣本與陰性對照樣本準(zhǔn)備好。
 

　　六、操作步驟
 

　　1.將酶標(biāo)板每個(gè)小孔內(nèi)填充50µL固定酶標(biāo)記性抗體時(shí)，將板制備至2-8℃下存儲20小時(shí)。
 

　　2.將液態(tài)樣品溶于樣品稀釋液中，使樣品達(dá)到適合檢測的濃度。樣品應(yīng)避免過度稀釋或過度濃縮。
 

　　3.然后，向每個(gè)小孔中加入50µl的稀釋后的樣品，以及50µl的陽性參考樣本、50µl的陰性對照樣本。
 

　　4.使用封板膜密封，并在37℃恒溫箱中孵化60分鐘。
 

　　5.丟棄所有的液體，并在試劑盒內(nèi)水龍頭下沖洗各個(gè)小孔以清除未被綁定的物質(zhì)。
 

　　6.將200υl洗板緩沖液加入每個(gè)小孔中，用廢液槽放置一段時(shí)間后，倒掉，重復(fù)此操作至少3次。
 

　　7.向每個(gè)小孔中加入50µl的HRP標(biāo)記羊抗人IgG，孵化37℃下30分鐘。
 

　　8.重復(fù)步驟6以清除未結(jié)合的物質(zhì)。
 

　　9.將50µl的HRP底物添加到每個(gè)小孔，并在黑暗中置于室溫靜止15分鐘。
 

　　10.停止反應(yīng)，加入50µl停止液應(yīng)用于每個(gè)孔中。
 

　　11.讀取OD值測量各小孔校準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本的質(zhì)量濃度。
 

　　七、規(guī)范化操作流程與關(guān)鍵質(zhì)控點(diǎn)
 

　　遵循規(guī)范化流程并嚴(yán)控關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，是獲得CV(變異系數(shù))合格、可靠數(shù)據(jù)的保障。
 

　　A. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備與試劑平衡
 

　　試劑回溫：將所有試劑盒組分從4℃取出，在室溫(20-25℃)下放置至少30分鐘，以達(dá)到溫度平衡。這能有效減少因溫度差異導(dǎo)致的孔間變異。
 

　　洗滌液配制：若提供濃縮洗滌液，需用去離子水或蒸餾水按說明書比例精確稀釋，并充分混勻。渾濁或未全部溶解的洗滌液會堵塞洗板機(jī)。
 

　　B. 加樣與孵育關(guān)鍵
 

　　加樣技巧：使用校準(zhǔn)過的移液器，槍頭垂直插入孔底(避免觸碰底部包被物)，緩慢加入樣品或試劑，避免產(chǎn)生氣泡。建議對標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行復(fù)孔檢測。
 

　　孵育條件：嚴(yán)格按說明書控制溫度(通常是37℃)和時(shí)間。孵育時(shí)，必須使用封板膜密封，防止液體蒸發(fā)和孔間交叉污染。避免孔板疊放過高導(dǎo)致受熱不均。
 

　　C. 洗滌——最易被忽視的成敗關(guān)鍵
 

　　洗滌要點(diǎn)：洗滌是去除未結(jié)合物質(zhì)、降低背景信號的核心。若用洗板機(jī)，應(yīng)定期校準(zhǔn)吸液、注液量；若手工洗板，需注意：
 

　　棄液后，將板在干凈吸水紙上拍干，以去除殘留液。
 

　　每孔加滿洗滌液，靜置30-60秒后再棄去，重復(fù)規(guī)定次數(shù)(通常3-5次)。
 

　　最后一次洗滌后，務(wù)必將孔內(nèi)液體拍干，但不可讓孔壁干燥過久。
 

　　D. 顯色與終止
 

　　顯色(避光)：加入底物液后，需在避光條件下孵育。顯色時(shí)間需嚴(yán)格控制，可觀察陽性孔顏色變化(通常為藍(lán)色)來決定終止時(shí)機(jī)，避免顯色過度導(dǎo)致“高鉤”效應(yīng)。
 

　　終止與讀數(shù)：加入終止液(通常為稀硫酸)后，顏色由藍(lán)變黃，應(yīng)在30分鐘內(nèi)于相應(yīng)波長(如450nm，并參考630nm作為參比波長)讀取OD值。讀取前，用無塵紙擦干板底部的冷凝水或污跡。
 

　　八、禁忌事項(xiàng)
 

　　1、本檢測盒內(nèi)禁止使用過期試劑。
 

　　2、禁止本試劑盒內(nèi)的試劑與其他試劑或活性物質(zhì)混合使用。
 

　　3、禁止口服或其他接觸本試劑盒內(nèi)的試劑。如發(fā)生皮膚敏感現(xiàn)象或可能影響人體內(nèi)部健康，應(yīng)進(jìn)行醫(yī)學(xué)干預(yù)。
 

　　九、適用范圍
 

　　本檢驗(yàn)盒被廣泛運(yùn)用于檢測各類疾病，如傳染病、自身免疫性疾病，腫瘤標(biāo)志物、突變基因等。
 

　　十、質(zhì)控
 

　　在正常操作中，該檢測盒可保證準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。如果使用中發(fā)現(xiàn)問題，請先嘗試實(shí)驗(yàn)操作流程，如仍然無法解決，可向生產(chǎn)廠家進(jìn)行垂詢。
 

　　以上就是對Elisa酶聯(lián)免疫試劑盒的說明書，希望各位用戶在使用本試劑盒時(shí)一定要加倍謹(jǐn)慎，按照說明書操作，以確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確無誤。